📁 Обзор дела: на Хэллоуин сыщикам достается чертовски хорошее дело, в котором клиент просит их помочь с определением содержания белка в молоке. Лейтенант Кукурумбо возглавляет команду, демонстрируя метод Кьельдаля для измерения содержания казеина в двух разных образцах молока. Интересно, понравятся ли результаты клиентке, или, наоборот, напугают ее так, что она побежит искать помощь в другом агентстве? Читайте дальше, чтобы узнать подробности.

В это прекрасное утро яркие листья переливаются золотом на низком осеннем солнце. Забираясь в багажник своего грузового велосипеда, сыщики испытывают профессиональное возбуждение, и Шалот Холмс везет их на встречу с клиентом. Они весело болтают на подъезде к молочной ферме, где клиентка уже рада показать им своих коров и угостить свежим молоком. Они сидят в ее саду в окружении корзин, наполненных тыквами и только что собранными яблоками, едят свежий пирог и приступают к обсуждению дела.

Хозяйка фермы развивает свой бизнес и хотела бы начать продавать свое молоко нескольким местным продуктовым магазинам. Однако ей нужно соблюдать строгие правила и нормы, включающие определение содержания белка в молоке. Именно для этого ей и понадобилась помощь сыщиков. Она планирует обратиться к местной испытательной лаборатории, чтобы проанализировать свои образцы, но предварительно она хотела бы снабдить их подробной инструкцией о том, каким именно методам нужно следовать, поскольку они не являются экспертами в области пищевой аналитики.

Сыщики уверяют ее, что подберут и продемонстрируют оптимальный способ, удовлетворяющий ее требованиям. Они снова садятся на велосипед и возвращаются в офис. Шалот Холмс жалуется, что ездить на велосипеде после съеденного пирога стало намного труднее, а сыщики смеются и подбадривают его.

Однако Шалот Холмс даже не мог себе представить, что за этим последует. Все пятеро сыщиков захотели вести дело об определении белка в молоке, и спор перешел допустимые границы. Яйкюль Пуаро настаивает, что знает о молоке больше всех, поскольку яйца белые, как и молоко. Мисс Маппл сопротивляется, утверждая, что ничто так не сочетается, как молоко и яблочный пирог. А Нэнси Биф хочет поучаствовать, потому что больше всего молока производят ее родственники.

Шалот Холмс решает примирить спорщиков с помощью опросника. Вопросы в нем звучат так:

1. Назовите основной белковый ингредиент в молоке.
Лейтенант Кукурумбо первым называет казеин.

2. Какая часть белковых составляющих молока приходится на казеин?
Нэнси Биф оказывается ближе всех к правильному ответу, отвечая, что казеин составляет почти 80% белка в молоке.

3. Как еще можно использовать казеин?
Лейтенант Кукурумбо опять оказывается быстрее всех, называя его применение в качестве добавки в медицине, а также техническое использование в качестве связующего в производстве косметической продукции, красок и клеев.

Итак, дело получает Лейтенант Кукурумбо! Несмотря на то, что он в большей степени является экспертом по БИК-анализу (ИК-спектроскопия в ближнем диапазоне), он с радостью готов попробовать себя в работе с классическими эталонными методами определения белка в молоке.

Быстро покопавшись в своих учебниках и в Руководстве по методу Кьельдаля, он начинает с общего обзора метода. Сыщики попробуют осадить казеин из пробы путем добавления раствора уксусной кислоты. Затем обработают фильтрат серной кислотой, чтобы преобразовать азот в сульфат аммония. В результате подщелачивания гидроксидом натрия сульфат аммония превращается в аммиак, который посредством перегонки с водяным паром поступает в приемник с борной кислотой, где он оттитровывается раствором соляной кислоты. Наконец, они определят содержание казеина, вычислив разницу между общим содержанием азота и содержанием неказеинового азота. Последний будет рассчитан с использованием данных об объеме титранта и массе образца.

Мисс Маппл, как эксперт по Кьельдалю, одобрительно кивает, и все пятеро приступают к выполнению плана по определению содержания белка в молоке. Сначала они покупают образцы двух типов: ультрапастеризованное цельное молоко и ультрапастеризованное частично обезжиренное молоко. Затем они начинают процесс минерализации молока по следующему протоколу:

1. Помещают 20,0 г образца в мерную колбу.
2. Добавляют 250 мл воды при 40 °C и 2 мл раствора уксусной кислоты (10%), затем энергично взбалтывают смесь в колбе для перемешивания и дают ей постоять примерно 10 минут.
3. Добавляют 2 мл раствора ацетата натрия (1 моль/л) и перемешивают вращательным движением.
4. Дают смеси остыть до температуры окружающей среды и наполняют колбу водой до калибровочной отметки.
5. Фильтруют смесь через бумажный фильтр и собирают весь фильтрат.
6. Помещают 50 мл фильтрата в пробирку для образцов емкостью 300 мл.
7. Добавляют 2 таблетки Кьельдаля, порцию серной кислоты (98%) 20 мл и стеариновую кислоту на кончике шпателя.
8. Готовят холостые пробы с использованием всех вышеперечисленных веществ, за исключением образцов.
9. Осторожно суспендируют образец, слегка покручивая пробирку.
10. К дигестору подключают скруббер для поглощения кислотных паров, образующихся в процессе минерализации.
11. Вставляют штатив с образцами в предварительно нагретый модуль.
12. Минерализуют образцы в соответствии с методом «npn (небелковый азот)/ncn (неказеиновый азот) в молоке» с параметрами, указанными ниже:

Шаг	Температура (⁰C)	Время (мин)
Предварительный разогрев	350	-
1	550	35
2	490	45
Охлаждение	-	30

По истечении времени они замечают, что пробирка с образцом стала сине-зеленой и непрозрачной. Мисс Маппл рекомендует продолжить минерализацию еще 30 минут, как в шаге 2. Это решает проблему. Они дают своим образцам остыть до комнатной температуры и переходят к фазе перегонки с паром и титрования в процессе определения белка в молоке.

Пищевые сыщики используют систему для перегонки с паром для анализа содержания азота по методу Кьельдаля и следующие параметры дистилляции:

Вода	80 мл
Гидроксид натрия	80 мл
Борная кислота (4%)	50 мл
Время реакции	5 c
Мощность пара	100%
Время дистилляции	240 c
Начало титрования	240 c
Тип титрования	Борная кислота
Скорость перемешивания при дистилляции	5
Скорость перемешивания при титровании	7

Наконец, они готовы произвести вычисления и получить результаты, показывающие содержание белка в молоке. Первое уравнение позволяет посчитать процентное содержание азота:

где:

wNCN : массовая доля неказеинового азота (г/г)

VSample : количество титранта на образец (мл)

VBlank : среднее количество титранта на холостую пробу (мл)

VFlask : мерная колба заданного объема (200 мл)

z : коэффициент молярной валентности (1 для HCl, 2 для H2SO4)

c : концентрация титранта (моль/л)

f : коэффициент титранта (для коммерческих растворов обычно 1,000)

MN : молекулярная масса азота (14,007 г/моль)

F : коэффициент объема осадка (0,994 – для цельного молока и 0,998 – для обезжиренного молока)

Для частично обезжиренного молока коэффициент рассчитывался с учетом его жирности. Коэффициент для частично обезжиренного молока составил 0,995.

mSample : вес образца (г)

%N : процентное содержание азота (%)

%NCN : процентное содержание неказеинового азота (%)

%Casein : содержание казеина (%)

6.38 : специфический для образца коэффициент пересчета азота на белок в молоке

Лейтенант Кукурумбо хлопает в ладоши от удовольствия. Пора увидеть результаты! В первую очередь, они смотрят на результаты определения казеинового белка в молоке:

Сначала они изучают образец цельного молока:

Цельное молоко	Масса образца (г)	Объем образца (мл)	%NCN (неказеинового азота)	Казеин (%)
Образец 1	20,3366	4,10	0,104	2,65
Образец 2	20,1807	4,01	0,102	2,66
Образец 3	20,2356	4,02	0,102	2,66
Образец 4	20,2655	4,05	0,103	2,65
Среднее			0,103	2,65
Относительное стандартное отклонение (%)			0,77	0,19

При этом средний объем для холостой пробы составлял 0,298 мл (n = 4), и казеин был рассчитан с учетом измеренного общего содержания азота 0,519%.

Затем они изучают данные для образца частично обезжиренного молока:

Частично обезжиренное молоко	Масса образца (г)	Объем образца (мл)	%NCN (неказеинового азота)	Казеин (%)
Образец 1	20,1807	4,10	0,103	2,63
Образец 2	20,1835	3,98	0,102	2,64
Образец 3	20,2192	3,96	0,101	2,64
Образец 4	20,2779	3,99	0,102	2,64
Среднее			0,102	2,64
Относительное стандартное отклонение (%)			0,64	0,16

При этом средний объем для холостой пробы составлял 0,298 мл (n = 4), и казеин был рассчитан с учетом измеренного общего содержания азота 0,515%.

Они быстро сравнивают свои результаты определения белка в молоке со стандартным методом VDLUFA VI C30.4:

	Метод Кьельдаля для определения белка	Стандартный метод VDLUFA VI C30.4
Пробирка для образца	Таблетки 10 г, содержащие - 47,7% K2SO4 - 47,7% Na2SO4 - 2,8% TiO2 - 1,8% CuSO4	4,10
Вода	80 мл	3,98

Они не замечают какого-либо влияния выбора катализатора на эксперимент, и отмечают, что для минерализации пробы им требуется меньше воды, чем при стандартном методе. Они удвоили объемы и массы до стадии фильтрации по сравнению со стандартным методом, но это было сделано только для того, чтобы получить достаточное количество фильтрата для обеспечения возможности разложения двух образцов при необходимости. Соотношение между образцом и используемыми химическими веществами соответствует официальному методу.

В итоге при определении белка в молоке с использованием дигестора и системы Кьельдаля команда получила надежные и воспроизводимые результаты с низкими относительными стандартными отклонениями, которые соответствуют литературным значениям. (Souci Fachmann Kraut, CRC Press, 7th edition, 2008).

Сыщики с радостью возвращаются на молочную ферму, чтобы сообщить клиентке о результатах экспериментов. Она очень рада, что нашла хороший метод определения белка в молоке, который можно передать в местную лабораторию для тестирования. Сыщики прощаются и снова садятся на свой грузовой велосипед. Наступает ночь, и пока Шалот Холмс крутит педали, четверо исследователей обнимаются под теплым одеялом, разглядывают ночное небо и Млечный Путь в этот очень удачный молочный день.