Глава 3

Сыщики знакомятся с Рамановской спектроскопией и проводят ее сравнение с технологией БИК

🗂 Обзор семинара: после успешного завершения первого дела сыщики проводят семинар, на котором они знакомятся с другими полезными методами, необходимыми для будущих расследований. В процессе обучения сыщики расширяют свои познания в области Рамановской спектроскопии (спектроскопии комбинационного рассеяния, КР) и приходят к пониманию, каким образом она дополняет метод спектроскопии в ближнем ИК-диапазоне (БИК, NIR), более часто используемый для анализа пищевых продуктов.

Шалот Холмс и остальные пищевые сыщики удобно устроились на диване, перед ними пустая электронная доска. После успешного закрытия дела с помощью методов Кьельдаля и жидкостной экстракции Шалот Холмс хочет провести семинар, посвящённый другому методу, широко используемому в пищевой аналитике: колебательной спектроскопии. В частности, цель сегодняшнего семинара – сравнить методы спектроскопии, используемые для анализа образцов пищевых продуктов.
Нэнси Биф нервно встает и берет пластиковый карандаш, чтобы изложить основные принципы колебательной спектроскопии для своих коллег. Она делает глубокий вдох и начинает объяснять.

Колебательная спектроскопия:

При столкновении молекулы с фотоном излучения с энергией, соответствующей волновым числам от 10 000 до 100 см-1, энергия фотона поглощается молекулой и преобразуется в колебательную энергию. Существует несколько типов колебательных движений молекул:

валентные колебания – возникают, когда межатомное расстояние между двумя атомами увеличивается или уменьшается вдоль оси химической связи, соединяющей их;
деформационные колебания – возникают, когда изменяется угол между двумя связями, принадлежащими одному и тому же атому, или когда группы атомов изменяют свое положение относительно остальной части молекулы.

Частота или длина волны поглощения, при которой возникают колебания, зависит от нескольких факторов:
• относительной массы атомов;
• прочности связи или от константы прочности связи;
• природы окружающих атомов.

Эти факторы отличаются у разных групп атомов, которые принято называть функциональными группами. Следовательно, характерные пики для каждого типа функциональных групп формируются с одинаковой или близкой частотой в зависимости от особенностей структуры всей анализируемой молекулы. Эта идея лежит в основе идентификации соединений с помощью колебательной спектроскопии.

Нэнси Биф оглядывает комнату. Остальные пищевые сыщики внимательно следят за ходом её рассуждений и понимающе кивают. Она говорит, что хотела бы продолжить обсуждение двух распространенных методов колебательной спектроскопии: спектроскопии комбинационного рассеяния (Рамана) и спектроскопии в ближней инфракрасной области (БИК). Мисс Маппл радостно восклицает, что очень любит японскую лапшу Рамэн. Нэнси Биф смеется и поправляет её, говоря, что речь пойдет не о Рамэновской, а о Рамановской спектроскопии. Затем она переходит к описанию метода.

Рамановская спектроскопия

Спектры комбинационного рассеяния получаются в несколько этапов:

1. Образцы облучают монохроматическим источником, например, лазером. При этом частота и энергия излучения должны быть выше резонансных частот колебаний молекулы.

2. Падающие фотоны вызывают временное искажение электронного распределения в молекулярных связях или изменяют поляризуемость этих связей, что приводит к поглощению фотонов.

3. Процесс поглощения способствует переходу электронов на виртуальный, неквантованный уровень энергии, с которого фотоны переизлучаются или подвергаются рассеянию и затем детектируются.

В целом, атомы более поляризуемы, если электроны находятся на внешних электронных оболочках, далеко от сферы влияния положительно заряженного ядра.
Рамановое излучение может рассеиваться либо упруго (без изменения длины волны излучения), либо не упруго (с изменением длины волны):
Стоксово рассеяние – неупруго рассеянное излучение имеет более низкую частоту, чем частота возбуждения;
Антистоксово рассеяние – неупругое рассеяние, происходит на более высокой частоте, чем частота возбуждения;
Рэлеевское рассеяние – упругое рассеяние, возникающее, когда фотон испускается с той же энергией, что и фотоны источника возбуждения.

Только неупруго рассеянные фотоны дают информацию о молекулярных колебаниях.

Стоксово излучение обычно предпочтительнее для анализа полученных данных, поскольку сигнал в этом случае более интенсивный, чем при антистоксовом рассеянии. Более интенсивный сигнал является следствием большей заселенности электронов в основном состоянии по сравнению с возбужденным состоянием.

Спектры комбинационного рассеяния регистрируются согласно сдвигу волнового числа от частоты возбуждения, которая эквивалентна частоте колебаний. Изменение энергии, вызываемое вибрацией, эквивалентно изменению, наблюдаемому при поглощении, если связь активна в инфракрасном диапазоне. Следовательно, рамановский сдвиг частоты и частота ИК-поглощения идентичны.

Рамановский сдвиг не зависит от длины волны возбуждения. При этом на интенсивность полосы комбинационного рассеяния влияют следующие факторы:

— поляризуемость молекулы;
— интенсивность источника;
— концентрация активных групп.

Фактически, интенсивность спектра комбинационного рассеяния прямо пропорциональна концентрации анализируемого вещества..

Понимая, что ее коллеги хорошо разбираются в другом типе колебательной спектроскопии, БИК, Нэнси Биф дает лишь беглый обзор этого метода.

БИК-спектроскопия

Для возбуждения молекулярных колебаний в БИК-спектроскопии применяют излучение в диапазоне от 10 000 до 4000 см-1. Молекулярные связи, наиболее чувствительные к возбуждениям на этой частоте, чаще всего являются полярными. Колебания молекул изменяют дипольный момент связи. Поглощение в ближней инфракрасной области менее интенсивно, чем требуется для спектров комбинационного рассеяния, что приводит к более глубокому проникновению исходного излучения в материал.

Нэнси Биф переходит к сравнению БИК- и Рамановской спектроскопии, наглядно демонстрируя, почему эти два метода часто считаются дополняющими друг друга.

Сходство между Рамановской и БИК-спектроскопией:

• оба метода обеспечивают характерный структурный «отпечаток пальца», позволяющий идентифицировать молекулу;
• оба метода неразрушающие и позволяют проводить исследования без повреждения образцов;
• оба спектрометра позволяют быстро провести анализ, за несколько минут или даже секунд;
• к обоим спектрометрам могут быть подключены внешние измерительные датчики и зонды, облегчающие доступ к образцам.

Различия между Рамановской и БИК-спектроскопией:

• Колебания с участием полярных связей (C-O, N-O, O-H, и т. д.) дают слабое комбинационное рассеяние, но будут хорошо поглощать в БИК-области. И, наоборот, неполярные связи (C-C, C=C, C-H) хорошо наблюдаются в спектрах комбинационного рассеяния света, но практически не идентифицируются с помощью БИК.
• Пики в БИК-спектре шире, чем пики комбинационного рассеяния, и имеют тенденцию перекрываться. Рамановские спектры имеют более резкие пики, соответствующие сигналам определенных связей. Также КР-спектры в некоторых случаях обладают более высокой селективностью и лучше подходят для анализа неизвестных структур.
• Вода хорошо поглощает излучение в ближней инфракрасной области спектра, но не активна в комбинационном рассеянии. Рамановский анализ может оказаться полезным, когда вода выступает основным мешающим компонентом (например, изучение кристаллизации в водном растворе). Если же, напротив, необходим именно анализ воды (например, наблюдение за процессом сушки), то тогда можно использовать метод БИК.
• БИК является предпочтительным методом для анализа некристаллических гидрофильных молекул, которые часто имеют очень слабый эффект комбинационного рассеяния. Тогда как более мелкие, ароматические, гетероциклические молекулы значительно лучше обнаруживаются с помощью комбинационного рассеяния света.
• Некоторые рамановские лазеры могут вызывать нагрев образца и нарушение его химической структуры. Лазерное возбуждение может также вызывать флуоресценцию или фотообесцвечивание образца (разрушение флюорофора), что влияет на базовую линию. Это особенно заметно для некристаллических (аморфных) образцов.

На этом Нэнси Биф решает завершить семинар, посвященный применению этих двух методов для исследования образцов продуктов питания. Она упоминает, что ИК-спектроскопия более широко используется, чем рамановская спектроскопия, скорее всего, из-за возможностей количественного обнаружения и более низкой стоимости БИК‑спектрометров. Однако отмечает, что нельзя игнорировать и преимущества рамановской спектроскопии, такие как, например, исследование водных систем.

Пять пищевых сыщиков соглашаются с эффективностью использования колебательной спектроскопии и оценивают эти методы как мощный инструмент многокомпонентного анализа для своих будущих расследований, связанных с образцами продуктов питания.
Команда решает взять на ужин японскую лапшу рамэн. Пять пищевых сыщиков отправляются ужинать, предвкушая новое дело.